SciRep
.05.15.
IF:5.
IntroductionMet是原癌基因与其生理配体的受体，肝细胞生长因子/散射因子（HGF/SF）的产物。HGF结合后，Met的C末端尾部会通过结合几种适配子蛋白而被 化，并激活许多下游信号传导途径。许多癌症，Met信号转导的异常激活都暗示了侵袭性肿瘤的生长，侵袭以及对其他靶向疗法的耐药性，使得Met成为了癌症治疗的有吸引力的靶标。
Cbl是受体酪氨酸激酶（RTK）的关键E3泛素连接酶，是RTKs14的重要负调节剂。激活RTK后，Cbl蛋白与RTK上的 化酪氨酸相互作用，导致其通过泛素化作用下调。LRIG1是RTK的另一个负调节剂，包括Met，并且以Cbl独立的方式工作。
我们研究了靶向Met的治疗性抗体SAIT介导LRIG1介导的Met下调的分子机制。本研究首次描述了LRIG1的泛素化及其作为LRIG1或LRIG1-Met复合物的溶酶体降解的触发因素，以及泛素特异性蛋白酶8（USP8）依赖性去泛素在调节LRIG1稳定性中的重要性。
Methods
在本研究中，我们发现SAIT可以诱导LRIG1泛素化，进而通过与Hrs相互作用促进Met和LRIG1复合物向溶酶体的募集，导致LRIG1和Met同时降解，我们还发现USP8可作为LRIG1特异的泛素化酶，并研究了USP8之间的相互作用。
Results一、Met靶向抗体对LRIG1的降解：
为了研究LRIG1介导的Met降解的潜在分子机制，我们首先检查了SAIT处理后LRIG1的细胞水平变化。用SAIT处理1小时后，LRIG1的总蛋白水平降低了EBC1细胞（图A）。
接下来，我们在固有LRIG1水平较低的MKN45细胞中过表达了Flag-LRIG1。SAIT强烈诱导了Met和LRIG1的相互作用(图B)。同时，在SAIT处理后，Met和LRIG1的水平均显着降低（图C），这表明SAIT诱导Met和LRIG1相互作用，并同时降解两个分子。
SAIT诱导的LRIG1和Met的这种伴随降解可通过刀豆球蛋白降解过程的特异性抑制剂刀豆霉素来完全预防（图D）。
综上所述，这些结果表明SAIT诱导了Met和LRIG1的相互作用以及随后两种蛋白的溶酶体降解。
二、LRIG1的泛素化促进LRIG1和Met的溶酶体降解：
我们首先研究了泛素是否可以修饰LRIG1，以及该修饰是否与SAIT诱导的Met降解有关。SAIT处理后泛素化LRIG1的水平显着增加（图a）。通过使用纯化的Flag-LRIG1蛋白进行的体外泛素化试验获得了相似的结果（图b）。
肝细胞生长因子调节的Tyr激酶底物（Hrs）通过通过泛素相互作用基序（UIM）与泛素结合而起作用，这对于有效分选泛素化的膜蛋白是必不可少的。由于SAIT既诱导LRIG1泛素化，又诱导LRIG1还原，因此我们假设泛素化的LRIG1依次与Hrs结合，从而导致LRIG1的溶酶体降解（进而导致Met-LRIG1复合体）。
我们首先检查SAIT或5D5结合是否导致不同底物的泛素化。当Flag-LRIG1在MKN45细胞中过表达时，SAIT诱导LRIG1的泛素化，而5D5诱导Met而非LRIG1的泛素化（图c）。此外，SAIT处理显着提高了与Hrs共免疫沉淀的LRIG1的水平，而5D5没有这种作用，实际上诱导了Met和Hrs的相互作用（图d）。LRIG1和Hrs的相互作用通过免疫荧光分析进一步证实，其中SAIT诱导LRIG1和Hrs共定位（图e）。随后的Met/LRIG1复合物的溶酶体降解通过溶酶体标记物（Lamp1）对LRIG1和Met的共定位进行了验证（图f）。这一机制将SAIT与其他激动性Met靶向抗体区分开来，后者能直接泛素化Met而不诱导LRIG1和Met的相互作用。实际上，SAIT阻断了Met（Y/5）的 化以激活信号，而激动剂抗体5D5则没有（图g）。
SAIT诱导的LRIG1泛素化通过与Hrs相互作用促进Met-LRIG1复合物向溶酶体的募集，从而导致Met和LRIG1的溶酶体降解。此外，通过规避Cbl依赖的Met泛素化并通过Crk循环，SAIT避免了Met的活化，这可能会导致Met降解过程中的激动作用。
三、USP8对抗LRIG1的泛素化：
泛素化是一种可逆的转录后修饰，可触发细胞表面受体的内在化和溶酶体降解。许多泛素化膜蛋白和受体的稳定性受USP2和USP–27等泛素化酶的控制。为了研究这两种酶是否也对LRIG1的泛素化负责，我们进行了免疫沉淀分析。USP8确实与LRIG1相互作用（图a）。有趣的是，SAIT处理显着降低了LRIG1和USP8的相互作用（图b）。这表明SAIT扰乱了USP8介导的LRIG1的调节，从而导致LRIG1降解。这也表明足够量的USP8可以抵消SAIT诱导的LRIG1降解。为了证实这一发现，USP8在异位过表达，并测量了LRIG1的蛋白水平。USP8的过表达大大降低了LRIG1的降解（图c）。
由于SAIT诱导LRIG1的泛素化在LRIG1的降解中起重要作用，因此我们研究了USP8对泛素化LRIG1的影响。SAIT处理显着增强了LRIG1的泛素化，而USP8的过表达则明显降低了LRIG1的泛素化（图d）。
为了确定内源性USP8是否使LRIG1泛素化，我们使用了shUSP8来降低EBC1细胞中内源性USP8的水平。shUSP8的敲低，但不是非靶向性的控制shRNA的敲低，显着增强了LRIG1的泛素化作用（图e）。
我们观察到，对三种USP8siRNA混合物的处理显着增强了SAIT介导的LRIG1泛素化，这进一步支持了USP8在LRIG1泛素化中的特异性（图f）。
四、USP8调节LRIG1介导的Met降解：
为了阐明USP8对LRIG1介导的Met降解的保护作用，用编码野生型USP8或突变USP8-CS的质粒转染EBC1细胞，该质粒为显性负突变，其中核心结构域上高度保守的Cys残基被Ser。USP8的过表达显着逆转了SAIT介导的LRIG1和Met的降解，而USP8-CS没有这种影响（图a）。这些结果表明，USP8的去泛素化活性对于通过LRIG1的去泛素化调节LRIG1和Met的蛋白质水平至关重要。
为了研究USP8在SAIT诱导的癌细胞生长抑制中的作用，我们用USP8，USP8-CS或shUSP8表达构建体转染了EBC1细胞。USP8的过表达几乎完全逆转了SAIT诱导的EBC1细胞的生长抑制。相比之下，通过转染USP8-CS或shUSP8降低USP8的功能水平可大大增强SAIT的抗肿瘤作用（图b）。
总体而言，这些数据表明USP8通过控制LRIG1的泛素化水平而充当LRIG1介导的Met降解的调节剂。
Discussion当前研究的发现突出了LRIG1介导的Met降解以及USP8在靶向Met的抗体对LRIG1泛素化的调控中的意义。需要进一步的研究来阐明联合治疗USP8抑制剂和靶向Met的抗体的临床益处。
Reference:USP8modulatesubiquitinationofLRIG1forMetdegradation
DOI:10./srep
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